SPEKTROFOTOMETRI

Pada spektrofotometri ini yang digunakan sebagai sumber sinar/energi adalah cahaya tampak (visible). Cahaya visible termasuk spektrum elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh mata manusia. Panjang gelombang sinar tampak adalah 380 sampai 750 nm. Sehingga semua sinar yang dapat dilihat oleh kita, entah itu putih, merah, biru, hijau, apapun.. selama ia dapat dilihat oleh mata, maka sinar tersebut termasuk ke dalam sinar tampak (visible).
Sumber sinar tampak yang umumnya dipakai pada spektro visible adalah lampu Tungsten. Tungsten yang dikenal juga dengan nama Wolfram merupakan unsur kimia dengan simbol W dan no atom 74. Tungsten mempunyai titik didih yang tertinggi (3422 ºC) dibanding logam lainnya. karena sifat inilah maka ia digunakan sebagai sumber lampu.
Sample yang dapat dianalisa dengan metode ini hanya sample yang memilii warna. Hal ini menjadi kelemahan tersendiri dari metode spektrofotometri visible.
Oleh karena itu, untuk sample yang tidak memiliki warna harus terlebih dulu dibuat berwarna dengan menggunakan reagent spesifik yang akan menghasilkan senyawa berwarna. Reagent yang digunakan harus betul-betul spesifik hanya bereaksi dengan analat yang akan dianalisa. Selain itu juga produk senyawa berwarna yang dihasilkan harus benar-benar stabil.
Salah satu contohnya adalah pada analisa kadar protein terlarut (soluble protein). Protein terlarut dalam larutan tidak memiliki warna. Oleh karena itu, larutan ini harus dibuat berwarna agar dapat dianalisa. Reagent yang biasa digunakan adalah reagent Folin.
Saat protein terlarut direaksikan dengan Folin dalam suasana sedikit basa, ikatan peptide pada protein akan membentuk senyawa kompleks yang berwarna biru yang dapat dideteksi pada panjang gelombang sekitar 578 nm. Semakin tinggi intensitas warna biru menandakan banyaknya senyawa kompleks yang terbentuk yang berarti semakin besar konsentrasi protein terlarut dalam sample.


2. Spektrofotometri UV (ultraviolet)

Berbeda dengan spektrofotometri visible, pada spektrofotometri UV berdasarkan interaksi sample dengan sinar UV. Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-380 nm. Sebagai sumber sinar dapat digunakan lampu deuterium.
Deuterium disebut juga heavy hidrogen. Dia merupakan isotop hidrogen yang stabil yang terdapat berlimpah di laut dan daratan. Inti atom deuterium mempunyai satu proton dan satu neutron, sementara hidrogen hanya memiliki satu proton dan tidak memiliki neutron. Nama deuterium diambil dari bahasa Yunani, deuteros, yang berarti ‘dua’, mengacu pada intinya yang memiliki dua pertikel.
Karena sinar UV tidak dapat dideteksi oleh mata kita, maka senyawa yang dapat menyerap sinar ini terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki warna. Bening dan transparan.
Oleh karena itu, sample tidak berwarna tidak perlu dibuat berwarna dengan penambahan reagent tertentu. Bahkan sample dapat langsung dianalisa meskipun tanpa preparasi. Namun perlu diingat, sample keruh tetap harus dibuat jernih dengan filtrasi atau centrifugasi. Prinsip dasar pada spektrofotometri adalah sample harus jernih dan larut sempurna. Tidak ada partikel koloid apalagi suspensi.
Sebagai contoh pada analisa protein terlarut (soluble protein). Jika menggunakan spektrofotometri visible, sample terlebih dulu dibuat berwarna dengan reagent Folin, maka bila menggunakan spektrofotometri UV, sample dapat langsung dianalisa.
Ikatan peptide pada protein terlarut akan menyerap sinar UV pada panjang gelombang sekitar 280 nm. Sehingga semakin banyak sinar yang diserap sample (Absorbansi tinggi), maka konsentrasi protein terlarut semakin besar.
Spektrofotometri UV memang lebih simple dan mudah dibanding spektrofotometri visible, terutama pada bagian preparasi sample. Namun harus hati-hati juga, karena banyak kemungkinan terjadi interferensi dari senyawa lain selain analat yang juga menyerap pada panjang gelombang UV. Hal ini berpotensi menimbulkan bias pada hasil analisa.


3. Spektrofotometri UV-Vis

Spektrofotometri ini merupakan gabungan antara spektrofotometri UV dan Visible. Menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda, sumber cahaya UV dan sumber cahaya visible. Meskipun untuk alat yang lebih canggih sudah menggunakan hanya satu sumber sinar sebagai sumber UV dan Vis, yaitu photodiode yang dilengkapi dengan monokromator.
Untuk sistem spektrofotometri, UV-Vis paling banyak tersedia dan paling populer digunakan. Kemudahan metode ini adalah dapat digunakan baik untuk sample berwarna juga untuk sample tak berwarna.


4. Spektrofotometri IR (Infra Red)

Dari namanya sudah bisa dimengerti bahwa spektrofotometri ini berdasar pada penyerapan panjang gelombang infra merah. Cahaya infra merah terbagi menjadi infra merah dekat, pertengahan, dan jauh. Infra merah pada spektrofotometri adalah infra merah jauh dan pertengahan yang mempunyai panjang gelombang 2.5-1000 μm.

Pada spektro IR meskipun bisa digunakan untuk analisa kuantitatif, namun biasanya lebih kepada analisa kualitatif. Umumnya spektro IR digunakan untuk mengidentifikasi gugus fungsi pada suatu senyawa, terutama senyawa organik. Setiap serapan pada panjang gelombang tertentu menggambarkan adanya suatu gugus fungsi spesifik.

4. Spektrofotometri IR (Infra Red)

Dari namanya sudah bisa dimengerti bahwa spektrofotometri ini berdasar pada penyerapan panjang gelombang infra merah. Cahaya infra merah terbagi menjadi infra merah dekat, pertengahan, dan jauh. Infra merah pada spektrofotometri adalah infra merah jauh dan pertengahan yang mempunyai panjang gelombang 2.5-1000 μm.
Pada spektro IR meskipun bisa digunakan untuk analisa kuantitatif, namun biasanya lebih kepada analisa kualitatif. Umumnya spektro IR digunakan untuk mengidentifikasi gugus fungsi pada suatu senyawa, terutama senyawa organik. Setiap serapan pada panjang gelombang tertentu menggambarkan adanya suatu gugus fungsi spesifik.
Hasil analisa biasanya berupa signal kromatogram hubungan intensitas IR terhadap panjang gelombang. Untuk identifikasi, signal sample akan dibandingkan dengan signal standard. Perlu juga diketahui bahwa sample untuk metode ini harus dalam bentuk murni. Karena bila tidak, gangguan dari gugus fungsi kontaminan akan mengganggu signal kurva yang diperoleh.
Terdapat juga satu jenis spektrofotometri IR lainnya yang berdasar pada penyerapan sinar IR pendek. Spektrofotometri ini di sebut Near Infrared Spectropgotometry (NIR). Aplikasi NIR banyak digunakan pada industri pakan dan pangan guna analisa bahan baku yang bersifat rutin dan cepat.
(Riyadi,Wahyu. 2009)


KEGUNAAN

Metode spektrofotometri adalah metode analisis berdasarkan pengukuran absorbsi cahaya oleh senyawa yang mengalami transisi elektron saat terkena sinar dengan panjang gelombang tertentu. Spektrofotometri merupakan salah satu cabang analisis instrumental yang mempelajari interaksi antara atom atau molekul dengan radiasi elektromagnetik. Salah satu penggunaan spektrofotometri adalah dapat menentukan kandungan kimiawi dari suatu bahan. Sumber cahaya ultraviolet dan cahaya tampak apabila dilewatkan pada sampel akan memberikan informasi nilai absorbansi dengan variasi panjang gelombang.
Alat yang digunakan untuk mengukur daya serapan dinamakan . Alat ini mengeluarkan cahaya pada jarak gelombang yang dipilih terlebih dahulu, lalu dipancarkan melalui sampel (selalu dilarutkan didalan satu pelarut dan diletakkan didalam kuvet), dan kecepatan cahaya yang ditransmisikan/diserap sampel tersebut diukur.
Terdapat dua jenis spektrofotometer, yaitu spektrofotometer beralur tunggal (single beam) dan spektrofotometer beralur ganda (double beam). Secara umum, sesebuah spektrofotometer terdiri dari komponen utama yaitu sumber cahaya, monokromator (termasuk beberapa penapis, celah (slits) dan cermin), kotak sampel, alat pengesan, dan sebuah meter atau perekam.

Sumber Cahaya
Bergantung kepada panjang cahaya, maka sesebuah spektrofotometer itu dapat mengukur daya serap pada kawasan ultraviolet, dimana lampu hidrogen atau deutrium tekanan tinggi digunakan; atau dikawasan tampak yang menggunakan lampu tungsten-halogen. Yang pertama itu mengeluarkan cahaya pada panjang gelombang 200 - 340 nm, manakala yang kedua itu pada panjang gelombang 340 - 800 nm. Alat yang mempunyai kedua-dua jenis lampu mempunyai kelenturan yang lebih baik dan boleh digunakan untuk kajian kebanyakan molekul yang mempunyai kepentingan biologi.

Monokromator
Kedua lampu diatas mengeluarkan cahayan pada keseluruhan panjang gelombang. Sehingga, sebuah spektrofotometer perlulah mempunyai sebuah sistem optik yang dapat memilih cahaya monokromatik (cahaya yang mempunyai panjang gelombang tertentu). Alat modern menggunakan prisma, atau selalu menggunakan diffraction grating untuk menghasilkan cahaya pada panjang gelombang tertentu. Perlu juga diingatkan disini bahwa cahaya yang keluar dari monokromator tidaklah terdiri dari hanya satu panjang gelombang, tetapi sebaliknya diperkaya dengan panjang gelombang tersebut. Ini bermakna, kebanyakan cahaya adalah dari panjang gelombang yang tunggal, tetapi yang pada panjang gelombang lebih pendek atau lebih panjang dari itu juga ada.
Sebelum cahaya monokromatik itu sampai kepada sampel, ia akan melalui satu siri celah (slits), kanta, penapis dan cermin. Sistem optik ini memekatkan cahaya, meningkatkan kelenturan spektra dan menumpukan ia kearah sampel. Cahaya yang melintasi dari monokromator ke sampel akan menemui satu pintu atau celah. Lebarnya celah ini menentukan kecepatan cahaya yang mengenai sampel dan kelenturan spektra cahaya tersebut. Dengan menyempitkan celah, kelenturan spektra akan meningkat, tetapi banyaknya cahaya yang mengenai sampel akan berkurang. Dalam hal ini kecekapan atau kepekaan alat pengesan akan menjadi faktor penting. Sehingga lebarnya celah perlu ditentukan untuk mendapatkan keseimbangan diantara kelenturan spektra dengan kepekaan pengesan.
Kotak Sampel

Cahaya monokromatik yang telah diproses itu kemudiannya diarahkan pada kotak sampel yang boleh menempatkan beberapa jenis pemegang sel. Sampel selalu dalam bentuk larutan. Sampel diisikan kedalam kuvet yang diperbuat dari kaca, kuarza, atau lain-lain bahan lutsinar. Kuvet kaca agak murah, tetapi disebabkan ia menyerap cahaya UV, ia hanya boleh digunakan untuk panjang gelombang melebihi 340 nm. Kuvet kuarza atau silika boleh digunakan disepanjang kawasan cahaya UV dan tampak (~200 - 800 nm). Kuvet sekarang ini banyak terdapat dipasaran dibuat dari polimetakrilat (280 - 800nm) dan polistiren (350 - 800nm).
Spektrofotometer yang kurang mahal terdiri dari alat beralur-tunggal (single-beam) yang membolehkan satu kuvet dimasukkan kedalam pemegang sel pada satu masa. Alat yang lebih canggih adalah beralur-dua (double-beam) yang boleh memuatkan dua kuvet, yang satu mengandungi sampek terlarut didalam suatu pelarut (kedudukan sampel) dan yang satu lagi mengandung pelarut tulin (kedudukan rujukan/control).

Pengesan
Kecepatan cahaya yang melintasi sampel kajian bergantung kepada banyaknya cahaya yang diserap oleh sampel tersebut. Kecepatan diukur oleh pengesan peka-cahaya, selalu merupakan sebuah tabung fotogandaan (photomultiplier tube, PMT). PMT mengesan jumlah tenaga cahaya yang kecil, menguatkannya melalui lata elektron (cascade of electrons) yang dipercepat oleh dinod (dynode), dan menukarkannya menjadi isyarat elektrik yang boleh dimasukkan kedalam sebuah meter atau perekam.

Meter dan Perakam
Alat dapat memberikan bacaan daya serapan dan /atau transmitans secara terus dalam bentuk analog atau digital. Alat ini sesuai untuk pengukuran pada panjang gelombang tunggal. Sekiranga pengimbasan (scanning) daya serapan lwn. panjang gelombang (A lwn. l) diperlukan, maka sebuah perakam (recorder) perlulah dipasang.
Pada masa ini kebanyakan spektrofotometer telah dilengkapi dengan komputer berserta perisian yang canggih bagi memudahkan pengaturan acara, parameter pengukuran, terutama untuk tujuan kajian kinetika.
(Mickeyamekan. 2009)


• Jenis-jenis Spektrofotometri
1. Spektrofotometri Infra Merah
Spektrofotometri Infra Red atau Infra Merah merupakan suatu metode yang mengamati interaksi molekul dengan radiasi elektromagnetik yang berada pada daerah panjang gelombang 0,75 – 1.000 µm atau pada Bilangan Gelombang 13.000 – 10 cm-1. Radiasi elektromagnetik dikemukakan pertama kali oleh James Clark Maxwell, yang menyatakan bahwa cahaya secara fisis merupakan gelombang elektromagnetik, artinya mempunyai vektor listrik dan vektor magnetik yang keduanya saling tegak lurus dengan arah rambatan.
Saat ini telah dikenal berbagai macam gelombang elektromagnetik dengan rentang panjang gelombang tertentu. Spektrum lektromagnetik merupakan kumpulan spektrum dari berbagai panjang gelombang. Berdasarkan pembagian daerah panjang gelombang sinar infra merah dibagi atas tiga daerah, yaitu:
• Daerah Infra Merah dekat.
• Daerah Infra Merah pertengahan.
• Daerah infra Merah jauh.
2. Spektrofotometri Raman
Interaksi Radiasi Elektro Magnetik (REM) dengan atom atau molekul yang berada dalam media yang transparan, maka sebagian dari radiasi tersebut akan dipercikkan oleh atom atau molekul tersebut. Percikan radiasi oleh atom atau molekul tersebut menuju ke segala arah dengan panjang gelombang dan intensitas yang dipengaruhi ukuran partikel molekul.
Apabila media transparan tersebut mengandung hanya partikel dengan ukuran dimensi atom (permukaan 0,01 A2) maka akan terjadi percikan radiasi dengan intensitas yang sangat lemah. Radiasi percikan tersebut tidak tampak oleh karena panjang gelombangnya adalah pada daerah ultraviolet. Radiasi hamburan tersebut dikenal dengan hamburan Rayleigh.
Demikian pula yang tejadi pada molekul-molekul dengan diameter yang besar atau teragregasi sebagai contoh molekul suspensi atau koloida. Percikan hamburan pada larutan suspensi dan sistem koloida panjang gelombangnya mendekati ukuran partikel molekul suspensi atau sistem koloid tersebut. Radiasi hamburan rersebut dikenal sebagai hamburan Tyndal atau hamburan mie yang melahirkan metode turbidimetri. Suatu penelitian yang sulit dengan hasil temuan yang sangat berarti, dalam ilmu fisika telah dilakukan oleh Chandra Venkrama Raman seorang ahli fisika berkebangsaan India, pada tahun 1928.
Menurut temuan Raman tampak gejala pada molekul dengan struktur tertentu apabila dikenakan radiasi infra merah dekat atau radiasi sinar tampak, akan memberikan sebagian kecil hamburan yang tidak sama dengan radiasi semula.
Hamburan yang berbeda dengan radiasi semula (sumber radiasi) tersebut berbeda dalam hal panjang gelombang, frekuensi serta intensitasnya dikenal sebagai hamburan Raman. Hamburan Raman tersebut memberikan garis Raman dengan intensitas tidak lebih dari 0,001% dari garis spektra sumber radiasinya.
3. Spektrofotometri Fluorescensi dan Fosforescensi
Suatu zat yang berinteraksi dengan radiasi, setelah mengabsorpsi radiasi tersebut, bisa mengemisikan radiasi dengan panjang gelombang yang umumnya lebih besar daripada panjang gelombang radiasi yang diserap. Fenomena tersebut disebut fotoluminensi yang mencakup dua jenis yaitu fluoresensi dan fosforesensi. Fluoresensi terjadi dalam selang waktu lebih pedek daripada fosforesensi. Selain itu kondisi yang menyebabkan fluoresensi dan fosforesensi pun berbeda. Fluoresensi biasa terjadi pada suhu sedang dalam larutan cair, sedangkan fosforesensi biasa terjadi pada suhu sangat rendah dan pada media pekat. Pada fluoresensi dan fosforesensi terjadi perubahan energi vibrasi molekul sebagai akibat darip enyerapan radiasi oleh molekul tersebut.
4. Spektrofotometri Resonansi Magnetik Inti
Sebelum era 1950 para ilmuwan khususnya yang berkecimpung dalam bidang kimia organik mersakan kurang puas terhadap apa yang telah dicapai dalam analisis instrumental. Kekurangpuasan mereka terutama dari segi analisis kuantitatif, penentuan struktur dan gugus hidrokarbon yang dirasa banyak memberikan informasi.
Pada waktu itu dirasa perlu menambah anggota teknik spektroskopi untuk tujuan lebih banyak memberikan informasi gugus hidrokarbon dalam molekul. Dua orang ilmuwan dari USA pada tahun 1951 yaitu Felix Bloch dan Edwardo M. Purcell (dari Harvard university) menemukan bahwa inti atom terorientasi terhadap medan magnet.
Selanjutnya menurut Bloch dan Purcell setiap proton di dalam molekul yang sifat kimianya berbeda akan memberikan garis-garis resonansi orientasi magnet yang diberikan berbeda.
Bertolak dari penemuan ini lahirlah metode baru sebagai anggota baru teknik soektroskopi yang diberi nama “Nuclear Magnetic Resonance (NMR)”.
Para ilmuwan di Indonesia mempopulerkan metode ini dengan nama spektrofotometer Resonansi Magnet Inti (RMI). Spektrofotometri RMI sangat penting artinya dalam analisis kualitatif, khususnya dalam penentuan struktur molekul zat organik. Spektrum RMI akan mampu menjawab beberapa pertanyaan yang berkaitan dengan inti atom yang spesifik seperti:
• Gugus apa yang dihadapi?
• Di mana lokasinya gugus tersebut dalam molekul?
• Beberapa jumlah gugus tersebut dalam molekul?
• Siapa dan dimana gugus tetangganya?
• Bagaimana hubungan gugus tersebut dengan tetangganya?
Hasil spektoskopi RMI seringkali merupakan penegasan urutan gugus atau susunan atom dalam satu molekul yang menyeluruh. (Rahma. 2010)


DAFTAR PUSTAKA

Mickeyamekan. 2009. Spektrofotometer. (http://mickeyamekan.blogspot.com/2009/02/spektrofotometer.html) di akses pada 4 April 2009

Rahma. 2010. Jenis-Jensi Spektrofotometri. (http://rahma-alchemist.blogspot.com/2010/03/jenis-jenis-spektrofotometri.html) di akses pada 3 April 2011

Riyadi, Wahyu. 2009. Macam Spektrofotometri dan Perbedaannya. (http://wahyuriyadi.blogspot.com/2009/07/macam-spektrofotometri-dan-perbedaannya.html) di akses pada 4 April 2011